Les prestations de recherche proposées sont :  

• Métabarcoding (16S,18S, ITS, GyrB…) : Analyses du microbiote d’une matrice  Illumina : 2x300pb (Chimie V3)  ONT : Full 16S : Amplification du gène 16S (V1-V9)
• Whole Genome Sequencing (WGS) – petits génomes (bactéries, archaea, virus) :  Illumina et ONT
• Séquençage d’Amplicons à façon  Illumina : de 100pb à 300pb      
• Capture de séquence – SureSelect Agilent  
• Design et préparation des banques   
• Séquençage interne ou externalisé selon la taille du projet 
• Fabrication de banques NGS : WGS pour toutes les espèces animales  RNA-Seq 

Externalisation du séquençage  : Plateformes INRAE ou autres institutions (CNRS, ENS...)

Données délivrées : La plateforme @BRIDGe fournit à l’utilisateur :  Un rapport de séquençage Les données de sortie : fichiers fastq démultiplexés contenant l'ensemble des reads générés par échantillon. 

Capture de séquences

La plateforme prend en charge, en collaboration avec l’utilisateur et Agilent, la conception du design spécifique des sondes de capture du projet puis réalise la fabrication des banques NGS (technologie Illumina) et la capture proprement dite. Les échantillons sont indexés puis multiplexés avant séquençage afin de minimiser les coûts.

Le séquençage peut être réalisé sur le séquenceur MiSeq de la plateforme ou externalisé en fonction de la taille de projet.

Les sondes biotinylées, ARN ou ADN de 60 à 120 bases désignées à façon, sont utilisées pour capturer des régions d’intérêt présentes dans les banques NGS fabriquées à partir de l’ADN génomique.

Les fragments d’ADN ciblés, liés aux sondes, sont capturés à l’aide de billes magnétiques couplées avec de la streptavidine, qui a forte affinité pour la biotine présente sur les sondes. Les lavages successifs permettent l’élimination des fragments non ciblés et le complexe sonde-séquence cible sera récupéré grâce à sa fixation au support aimanté. Une amplification par PCR, d’une dizaine de cycles, permet d’augmenter la quantité de séquences et de dégrader les sondes. Le séquençage est ensuite réqlisé sur un séquenceur de la gamme Illumina (MiSeq, NextSeq ou HiSeq) selon le nombre de cibles et/ou d’échantillons.

Equipements associés : Bioanalyzer 2100, Qubit 2.0

Séquençage de petits génomes entiers (bactéries, archaea, virus)

Pour le séquençage de génome entier, l'ADN entier est fragmenté (traitement enzymatique et/ou mécanique), suivi d’une ligation aux adaptateurs Illumina. La banque ainsi obtenue contient de nombreux fragments qui sont séquencés un à un, plutôt que de cibler un locus génomique spécifique.

Séquençage Amplicons

Le séquençage Amplicon est une approche ciblée pour l’analyse des variations génétiques de régions génomiques spécifiques.

Les régions d’intérêt sont ciblées à l’aide de couples d’amorces spécifiques suivi d’un séquençage NGS des amplicons générés.

De 16 à 1536 cibles peuvent être séquencées en parallèle avec une taille comprise entre 150 pb et 1,5kb selon le protocole de fabrication de banques choisi. Le multiplexage des amplicons permet d’accéder simultanément à nombreuses régions d’intérêt.

Les primers utilisés sont créés à façon soit directement par l’utilisateur en collaboration avec la plateforme soit en collaboration avec la société Illumina via le kit TruSeq Custom Amplicon (TSCA). Possibilité de séquencer jusqu’à 1536 amplicons en parallèle.

Séquençage 16S et 18S

Le séquençage 16S permet de séquencer un gène connu au lieu d'un génome complet. Le gène ciblé est l'ARN 16S ribosomal (16s rDNA) qui est spécifique des bactéries, présent chez toutes les espèces et qui contient suffisamment de régions variables pour discriminer chaque espèce.

Le microbiote est l’ensemble des bactéries associées à un organe ou une région anatomique: intestin, rumen, poumon, cavité buccale.

Le séquençage 16S est la méthode classiquement utilisée pour identifier les espèces présentes dans le milieu étudié et déterminer leurs abondances respectives. Cette étude fait appel à une technique de séquençage haut débit et d'analyse bio-informatique des génomes.

Ce gène de 1500pb est constitué de 9 régions variables (V1 à V9) intercalées de régions conservées. Ceux sont ces régions variables qui sont utilisées pour la classification phylogénique des différentes populations bactériennes (genre, espèces, familles…).

De la même manière, l’étude phylogénique des eucaryotes est réalisée grâce au séquençage 18S.

Le séquençage est réalisé sur un séquenceur MiSeq d’Illumina en 2x300pb – chimie v3.

Worflow métagenomique de l’activité "Séquençage 16S et 18S" de la plate-forme @BRIDGe